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限制性显示技术分离差异表达基因—Mac30
干／祖细胞丰富，免疫活性低等优点已成为极有潜力的造血干细胞来源而用于临床但由于单份脐血细胞绝对数量少，尚不能满足成人移植的需要，解决成人移植的关键问题是进行有效的脐血扩增和采用合适的植入方案以改善移植效率。我们以裸鼠作模型探讨扩增后脐血造血细胞经腹腔输注在体内的植入能力。材料和方法1脐血来自浙江大学医学院附属妇产科医院，排除HIV、HBV、HCV、CMV和梅毒感染的健康足月分娩产妇，无菌采集，肝素抗凝。采集后4h内用羟乙基淀粉(HES)沉降法分离单个核细胞(MNC)，分别行MNC计数和C细胞检测2脐血造血细胞体外扩增培养RPMI1640培养基中含体积分数为10％的新生小牛血清(坑州四季青生物1二程材料有限公司)，rhGM—CSF150rig／ml(军事医学科学院基础医学研究昕)，rhIL-350U／ml(北京邦定泰克生物技术公司)，dllL-61130)u／~(JL京邦定泰克生物技术公司)，TNF-a100U／ml(北京白鹭园生物技术有限公司)，植物血凝素(P}{A)10tc4m~，接种细胞密度为1、0×1／ml,[link widoczny dla zalogowanych]，置37℃．体积分数为5％的c培养箱中培养，每周半量换液2次，7～14d行MNC计数和CD34细胞检测。3流式细胞仪(FCM)分析细胞表面标志将鼠抗人C单抗FrIE—HPCA一2(BDIS、USA)与l细胞常温下反应15min，PBS洗涤后，l0g／L多聚甲醛固定，FCM(FACS400，BDIS、USA)分析。作者单位：310009杭州，浙江人学医学院附属第二医院血液科(赵小英、吴东、徐荣臻、周旋、张晓红)、放疗科(王连聪)；浙江大学肿瘤研究所(吕庆华)；浙江大学医学院附属妇产科医院(严菊浓)4裸鼠脐血移植BALB／c裸鼠(浙江大学医学院实验动物中心提供)，雌雄各半，6～7周龄，体重l4～16g，无特定病原体条件下饲养移植前3h接受x线照射预处理，照射面积35…×35Cnl，照距100Cnl，剂量率200cGy／min，照射时间2．0～2．5nin，总剂量400～500cGy实验分组：①新鲜脐血输注组l6只，经腹腔输注新鲜脐血300，含MNC(1．0～1．5)×l()b,[link widoczny dla zalogowanych]；②实验组：l4只，经腹腔输注与新鲜脐血组相等细胞数的扩增后脐血300，MNC(0．5～1．0)×lo7；③阴性对照组6只：输注等量的无细胞培养液。5脐血植人裸鼠体内的检测输注后满8周处死裸鼠,[link widoczny dla zalogowanych]，取外周血，两侧股骨的骨髓细胞及脾脏细胞，用于人c细胞的检测及抽提基因组DNA检测人特异的AJu序列和Cart一1基因。5．1外周血及骨髓c细胞的检测：用肝素抗凝心脏抽血法获取裸鼠外周血，生理盐水冲出裸鼠两侧股骨的骨髓细胞，用l0g／IJ草酸胺溶红细胞后制成白细胞悬液、涂片待用；采用亲合素一生物素．过氧化物酶复合法检测c细胞。链霉菌抗生物素蛋白一过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒，AEC酶底物试剂盒及鼠抗人c单抗均来自M~LxrnBiotch公司，按说明书操作5，2PCR法检测人特异的u序列和Cart一1基因：以人外周血白细胞基因绀DNA为阳性对照，正常裸鼠骨髓基因组DNA为阴性对照。酚／氯仿法抽提移植裸鼠骨髓、脾脏细胞基因组DNAPCR引物均由上海申友生物有限公司合成，Alu序列引物正义链为5'-口bGGCGACAGAACGAGAA|r-3．反义链为5'-CI'CACI'ACTFGGTGACAGGTFCA一3,[link widoczny dla zalogowanych]，扩增片段长224bp，为位于人x染色体上重复序列；caJt一1基因引物的正义链为5'-AAGGATACCACAATAA~一3，反义链为5一
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